(۱۰۰۰cc)

۵
۵
۱۰
۱۵
LA (1000cc)
میگروگرم برای
ml1000
۵
۵
۱۰
۱۵
LB(1000cc)

۵
۵
۱۰
—————–
LB(cc1000(
میگروگرم برای
ml1000
۵
۵
۱۰
——————
با آب مقطر به حجم مورد نظر رسانده و سپس اتوکلاو می کنیم.
– در زیر هود و کنار شعله، آنتی بیوتیک را به محیط کشت اضافه کرده و به پلیت ها منتقل میکنیم. وپس از خنک شدن پلیت ها را در یخچال نگهداری می کنیم.
پروتکل Compatent:
از محیط کشت سوش DH5α به کمک لوپ و در کنارشعله سلولها را به ml 10 از LB بدون آنتی بیوتیک که در فالکون
cc50 ریخته شده بود منتقل میکنیم و در داخل انکوباتور°C 37 و روی شیکر با سرعت RPM 250 به مدت یک شبانه
کشت میدهیم. صبح روز بعد µL500 از محیط را برداشته و به ML50 محیط LB بدون آنتی بیوتیک که در داخل ارلن است
منتقل کرده و به مدت ۲ ساعت در °C 37 و روی شیکر با سرعت RPM 250 کشت میدهیم. در این فاصله به منظور
نگهداری طولانی مدت سوش باکتری باقیمانده به روش زیر عمل میکنیم.
*روش نگهداری سوش(Stock ):
به منظور نگهداری طولانی مدت سوش باکتری، باقیمانده محیط کشت (ml 5/9) که در فالکون باقیمانده است، در ۴ درجه با
دورg 1600 به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفوژ میکنیم, تا سلولها کاملا ته نشین شوند. سپس با سمپلر محیط کشت را کاملا از
روی سلولها خارج کرده و سپس حدود Lµ ۶۵ محیط تازه روی سلولها ریخته و Lµ ۳۵ گلیسرول (۱۰۰%( اتوکلاو شده به
آن افزوده به آرامی سلولها را مخلوط و با حجمهای مساوی به ده میکروتیوبml 5/1 اتوکلاو شده منتقل کرده، درب آنرا با
پارافیلم محکم بسته و در ۸۰- درجه نگهداری می کنیم.
– OD سلولهای محیط کشت درون ارلن که برای دو ساعت در انکوباتور شیک شده بود را برای اطمینان از رسیدن آنها به فاز
لگاریتمی رشد، بررسی کرده و پس از اطمینان از این موضوع محتوی ارلن را به فالکون ml50 منتقل کرده و به مدت ۱۵
دقیقه بطور کامل در یخ فرو میبریم و سپس در °C 4 با دورg 1600 به مدت ۷ دقیقه سانتریفیوژ میکنیم تا رسوب سلولها


دیدگاهتان را بنویسید