فوریه 26, 2021

دانلود پایان نامه تولید نوروسفر از سلول­ های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان

متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته : زیست شناسی

گرایش : گرایش بافت شناسی و جنین شناسی

عنوان : تولید نوروسفر از سلول­ های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان

وزارت علوم، تحقیقات و فناوری

دانشکده زیست شناسی

پایان نامه کارشناسی ارشد

زیست شناسی (گرایش بافت شناسی و جنین شناسی)

عنوان:

تولید نوروسفر از سلول­ های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان

استاد راهنما:

دکتر مریم حاجی قاسم کاشانی

اساتید مشاور:

دکتر محمد تقی قربانیان

دکتر تقی لشکر بلوکی


(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)
تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :
(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)
فهرست مطالب:
فصل اول: مقدمه……………………………………………………………………. 1
مقدمه و مروری بر مطالعات گذشته………………………………………………. 1
1-1 سلول­های بنیادی جنینی……………………………………………………… 3
1-2 سلول­های بنیادی بالغ…………………………………………………………. 4
1-3 سلول­های بنیادی مغز استخوان………………………………………………. 5
1-3-1 مارکرهای سطحی خاص سلول­های بنیادی مزانشیمی………………… 8
1-3-2 تنظیم سیستم ایمنی توسط سلول­های بنیادی مزانشیمی…………… 8
1-3-3 پتانسیل تمایزی سلول­های بنیادی مزانشیمی…………………………. 10
1-4 کاربرد درمانی سلول­های بنیادی مزانشیمی………………………………. 14
1-5 انواع فاکتورهای رشد عصبی (NTFs) و ساختمان مولکولی گیرنده­های مربوط به آن­ها…17
1-5-1 فاکتورهای نوروتروفیک…………………………………………………….. 17
1-5-1-1 انواع فاکتور­های نوروتروفیک…………………………………………… 18
1-5-2 گیرنده­های مربوط به فاکتورهای رشد عصبی…………………………. 20
1-5-2-1 ساختار گیرنده P75NTR و اتصال نوروتروفین…………………………. 20
1-5-2-2 ساختار گیرنده Trk و اتصال نوروتروفین……………………………….. 22
1-6 سلول­های بنیادی عصبی……………………………………………………. 25
1-6-1 نوروسفر…………………………………………………………………….. 25
1-6-1-1 نوروسفر منبعی برای سلول درمانی………………………………….. 31
1-7 ضرورت اهداف تحقیق………………………………………………………… 33
فصل دوم: مواد و روش­ها…………………………………………………………… 35
2-2 تهیه و نگهداری حیوان آزمایشگاهی……………………………………….. 36
2-2 جداسازی و کشت سلول­های بنیادی مغز استخوان موش صحرایی بالغ…36
2-2-1 طرز تهیه محیط کشت a-MEM…………………………………………….
2-2-2 طرز تهیهPBS   فاقد كلسیم و منیزیم (2/7 : PH)………………………. 37
2-2-3 طرز تهیه تریپسین/ EDTA…………………………………………………
2-2-4 روش جداسازی و کشت سلول­های بنیادی مغز استخوان……………… 39
2-2-5 پاساژ سلولی……………………………………………………………… 39
2-3 تأیید هویت سلول‌های استرومایی به روش ایمونوسیتوشیمی………. 39
2-3-1 ایمونوسیتوشیمی CD71………………………………………………..
2-3-1-1 طرز تهیه پارافرمالدئید 4%…………………………………………….. 41
2-3-1-2 طرز تهیه ژلاتین 1/0 درصد…………………………………………….. 41
2-3-1-3 ساخت سرم بز 10%…………………………………………………… 41
2-3-1-4 طرز تهیه PBS  ایمنوسیتوشیمی (4/7 – 2/7 = PH)……………….. 42
2-3-1-5 طرز تهیه بافر گلیسرول………………………………………………….. 42
2-3-2 رنگ آمیزی آلکالین فسفاتاز………………………………………………. 43
2-4بررسی مارکر عصبی  βIII-tubulin در سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان  به روش ایمونوسیتوشیمی….44
 2-5 تایید هویت عصبی نوروسفر­ها به روش ایمونوسیتوشیمی…………… 45
2-6 بررسی مولكولی بیان ژن­های اعضای خانواده نوروتروفین……………….. 46
2-6-1 استخراج RNA كل از سلول‌های كشت شده …………………………..46
2-6-2بررسی کمی و کیفی RNA استخراج شده…………………………….. 48
2-6-3 الكتروفورز ژل آگارز …………………………………………………………49
2-6-4 واکنش ساخت cDNA (واکنش رونویسی معکوسRT-)……………… 52
2-6-5 انتخاب پرایمر……………………………………………………………… 53
2-6-6 آماده‌سازی پرایمرها……………………………………………………… 54
2-6-7 واكنش PCR……………………………………………………………….
2-7 آنالیز آماری………………………………………………………………….. 58
فصل سوم: نتایج…………………………………………………………………. 59
3-1 مشاهده مورفولوژی سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان در شرایط کشت با میکروسکوپ اینورت….59
3-2 تعیین هویت سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان با نشانگر CD71 و آلکالین فسفاتاز….60
3-3 ویژگی­های مورفولوژیکی سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان بعد از کشت طولانی مدت….60
3-4 تأیید هویت سلول‌های عصبی با بهره گرفتن از روش ایمونوسیتوشیمی….60
3-5 تأیید هویت نوروسفر­ها با بهره گرفتن از نشانگر نستین……………….. 61
3-6 ارزیابی بیان ژن­های فاكتورهای نوروتروفیک و مارکرهای نورونی و بررسی آماری شدت باند­ها و نمودار­های مربوط به آن…61
4-1 نتیجه ­گیری و بحث………………………………………………………… 70
4-1 مورفولوژی سلول­های بنیادی مزانشیمی در کشت طولانی مدت و تایید هویت آن­ها…71
4-2 بیان فاکتورهای رشد عصبی به وسیله سلول­های بنیادی مزانشیمی…72
4-3 پتانسیل تمایز سلول­های بنیادی مغز استخوان به سلول­های عصبی……74
4-4 تولید نوروسفر از سلول­های بنیادی مغز استخوان در كشت طولانی مدت….76
4-5 نتیجه گیری…………………………………………………………………… 77
پیشنهادات…………………………………………………………………………. 77
مراجع ………………………………………………………………………………..79
چکیده:
هدف : هدف ما در این پژوهش پاسخ به این سوال است که  آیا MSCs  بعد از کشت طولانی مدت می­توانند به طورخود­بخودی به سلول­های پیش­ساز عصبی تمایز یابند.
مواد وروش­ها: این تحقیق شامل دو گروه می­باشد: کشت پاساژ پنجم MSCs  در محیط کشت -MEMα و  FBS %10  به مدت سه هفته بدون تعویض محیط یا استفاده از  القاگر به عنوان گروه آزمایشی و پاساژ پنجم MSCs بدون کشت طولانی مدت به عنوان گروه کنترل. سپس هر گروه توسط واکنش زنجیره­­ای پلیمراز(RT- PCR) به منظور بیان ژن­های فاکتور­های نوروتروفیک ( NGF، BDNF، NT3، NT4/5و GDNF) و ژن­های نورونی (Nestin،TH  وNurr1) ارزیابی شد. در این مطالعه، از ایمینوسیتوشیمی Nestin و βІІІ-tubulin  به منظور تعیین سلول­هایی که این نشانگر­ها را بیان می­ کنند استفاده شد.
نتایج: پاساژ پنجم MSCs که از موش صحرایی بالغ استخراج شدند، بعد از کشت طولانی مدت (سه هفته) قادرند بطور خودبخودی به سلول­های شبه نوروسفری تمایز یابند و به نشانگر نستین پاسخ مثبت می­دهند. بعد از هفته دوم کشت، سلول­های شبه نورونی به نشانگر  βІІІ-tubulin واکنش مثبت نشان دادند. بررسی­های آماری نشان داده است که  MSCs در گروه آزمایشی افزایش معنی­داری از ژن­های فاکتور­های نوروتروفیک  NGF و  GDNFو ژن­های نورونی  Nestinو Nurr1 را نسبت به گروه کنترل نشان دادند    .(p<0.05)  
نتیجه گیری:  در این مطالعه نشان داده شد که MSCs در کشت طولانی مدت، به طورخودبخودی به نوروسفر تمایز پیدا می­ کنند بدون اینکه با فاکتور رشد یا القا­کننده خاص همراه شوند و قادرند ژن­های اختصاصی نورون­های دوپامینرژیک مانند  THو Nurr1را بیان کنند. مطالعات ما نشان می­دهد که  MSCsدر شرایط کشت طولانی مدت توانایی تمایز به سلول­های نورونی را به طور خودبخودی دارا هستند و پیشنهاد می­ شود منبع سلولی مناسبی در درمان بیماری­های نورولوژیکی باشند.
فصل اول: مقدمه و مروری بر مطالعات گذشته
مقدمه:
امروزه تحقیق بر روی سلول­های بنیادی به دانش پیشرفته­ای تبدیل شده است که نه تنها در حیات علمی، بلکه در بعد اقتصادی نیز موثر قلمداد می­ شود ]1[. سال­هاست که این تفکر در ذهن دانشمندان شکل گرفته که با توجه به امکان تقسیم سلولی آیا می­توان درمان را بر پایه این سلول­ها بنا نهاد. این تفکر و تحقیق به تدریج به طرف طب جدیدی سوق داده می­ شود که از آن به عنوان reparative (regenerative) medicine نام برده می­ شود] 2[. پر واضح است برای رسیدن به این هدف، درک کامل بیولوژی سلولی و ماهیت سلول­های بنیادی از اهمیت ویژه­ای برخوردار است. خصوصا” علی­رغم تحقیقات وسیع، هنوز ابهامات متعددی پیرامون نحوه عملکرد سلول­های بنیادی وجود دارد ]3[.
سلول­های بنیادی، سلول­های زایای[1] غیر بالغ­اند که قادر به خود تکثیری (Self-renewal) هستند و از این طریق جمعیت سلولی خود را حفظ می­ کنند]4[. هر سلول بنیادی در کنام یا نیچ[2] تنظیمی خود قرار گرفته است. کنام یک سلول، مجموعه ­ای از عوامل فیزیکی و شیمیایی است که سلول را احاطه کرده است. از اعمال مهم کنام سلول­های بنیادی، تنظیم توازن بین خود نوزایی و تمایز است. یکی از مکانیسم­های تنظیم کننده این توازن کنترل تقسیم متقارن[3] و نامتقارن[4] می­باشد. در تقسیم نامتقارن، از تقسیم سلول ­بنیادی دو سلول دختری ایجاد می­گردد که یکی در کنام باقی مانده و دیگری کنام را ترک کرده تا تعداد زیادی پیش­ ساز ایجاد نماید و در نهایت به سلول­های بالغ تمایز پیدا می­ کنند. در عوض در تقسیم متقارن، دو سلول­دختری ایجاد می­گردد که هر دو در کنام باقی مانده و به صورت بنیادی باقی می­مانند] 5، 6[. بنابراین سلول­های بنیادی، سلول­های تمایز نیافته­ای می­باشند که توانایی خود تکثیری، تولید نسل تمایز یافته عملکردی و ترمیم بافت بعد از صدمه را دارا هستند ]7[.
سلول­های بنیادی بر اساس قابلیت تمایز به سه گروه تقسیم می­شوند:
همه توان[5]: جزء اولین سلول­هایی هستند که در جنین شکل می­گیرند ( از تخمک لقاح یافته 1-3 روزه)،  قابلیت تمایز به انواع سلول­های ارگانیسم را دارند] 4[.
پر توان[6]: از توده سلولی داخلی[7] در مرحله بلاستوسیست 100تا 200 سلولی منشاء می­گیرند. این سلول­ها دارای توانایی تمایز و تکثیر نامحدود هستند و قادرند به هر سه لایه سلولی تمایز یابند]7[.
چند توان[8]: این گروه را سلول­های بنیادی بالغ[9] و یا سلول­های بنیادی سوماتیک نیز می‌نامند که بصورت خاموش و غیر متعهد حفظ می­شوند تا در آینده و بر اساس نیاز فعال شده و به سایر دودمان­های مربوط به همان بافت تمایز یابند]8[، به عنوان مثال سلول­های بنیادی خونساز در مغز استخوان به تمام انواع سلول­های خونی مانند گلبول‌های قرمز، لنفوسیت‌های B وT  و … تمایز می‌یابند [9،10[.
سلول­های بنیادی از لحاظ منشاٴ به دو دسته­ی، سلول­های بنیادی جنینی (ESCs)[10] و سلول­های بنیادی بالغ تقسیم می­شوند. از آنجا که استفاده از سلول­های بنیادی جنینی با مسائل اخلاقی و قانونی بسیار مواجه است و یا پیوند این سلول­ها خطر ایجاد بافت توموری را در پی خواهد داشت ]7،11[، بنابراین کلید حل این مشکل به دست آوردن منبع عظیمی از سلو­ل­هاست به گونه­ ای­که قابلیت تمایز بالایی داشته باشد و قادر باشند به دفعات نامحدودی در محیط کشت تکثیر شوند تا تعداد کافی سلول قابل دسترس برای پیوند و یا هر کاربرد درمانی و پژوهشی فراهم آورد]4[.
سلول­های بنیادی مزانشیمی از مهم­ترین سلول­های بنیادی بالغ است. این سلول­ها اولین بار توسط مطالعات Friedenstein  و Petrokova در سال 1966 استخراج شدند ]12[. سلول­های بنیادی مزانشیمی توان تمایز به چندین دودمان سلولی ازجمله استخوان، عصب، غضروف و كبد را دارند] 13 .[این سلول­ها به عنوان یک منبع ایده­آل برای سلول درمانی، ژن درمانی و به عنوان ابزاری برای درمان بیماری­های مادرزادی محسوب می­گردند] 14[. گزارش­هایی مبنی بر استفاده از این سلول­ها در مدل­های حیوانی برای درمان جراحات نخاعی] 15،16[، سكتة مغزی ]17 [و پاركینسون] 18 [وجود دارد.
1-1- سلول­های بنیادی جنینی
اولین تحقیقات در زمینه  ESCs در دهه 1960 شروع شد، هنگامیکه Finch و   Ephrussii درسال1960 ، سلول­های سرطانی جنینی چند توان را از سلول­های زایای سرطانی تمایز نیافته انسان و موش جدا کردند] 19.[
این سلول­ها اولین بار در سال1981 از توده سلولی داخلی جنین موش جدا سازی شدند، سپس در سال 1998، سلول­های بنیادی جنینی انسان استخراج شدند] 20،10.[ سلول­های بنیادی جنینی فعالیت تلومرازی شدیدی دارند و قادرند به طور نامحدودی تقسیم شوند، به گونه‌ای كه سلول­های بنیادی جنینی انسانی را می‌توان در شرایط محیط كشت تا بیش از یكسال به صورت تمایز نیافته حفظ كرد و جمعیت آنرا به 80 برابر رساند] 10.[  حضور آلکالین فسفاتاز و تلومراز و بیان نشانگر اختصاصی SSEA-1 از ویژگی­های اختصاصی سلول­های بنیادی جنینی می­باشد] 21.[
 این سلول­ها از توده سلولی داخلی بلاستوسیست جداسازی می­شوند که دارای توانایی تمایز و    تکثیر نامحدود هستند و قادرند به هر سه لایه سلولی تمایز یابند، این ویژگی را Pluripotent  می­نامند. محققین اولین بار این سلول­ها را از mice  و اخیرا” از انسان و پریمات­ها جداسازی کرده ­اند] 22، 23[. یک نکته مورد توجه در ارتباط با سلول­های بنیادی جنینی موش این است که این سلول­ها پس از آنکه در محیط کشت و شرایط آزمایشگاهی قرار می­گیرند، تکثیر شده و بعد از پیوند به جنین­ در مرحله قبل از کاشته شدن، ویژگی پلوری­پوتنتی خود را حفظ کرده و قادرند انواع بافت­های تمایز نیافته با منشا اکتودرمال، مزودرمال و اندودرمال را تولید کنند ]7، 24[ مشابه همین ویژگی­ها در سلول­های بنیادی جنینی انسان نیز دیده شده است ]7[. بنابراین گرچه سلول­های بنیادی جنینی از قدرت تكثیر و تمایز بالایی برخوردارند اما كاربرد این سلول­ها با موانع اخلاقی و قانونی همراه بوده و پاسخ ایمنی را در فرد گیرنده افزایش می‌دهند [7،11،10]. علاوه بر آن وقتی سلو­ل­های بنیادی جنینی انسان یا موش به حیوانات  متولد شده پیوند زده می­ شودند تولید تومور می­ کنند که حاوی انواع متفاوتی از بافت­ها شامل: پوست، مو و عضله می­باشد که تراتوما نامیده می­ شود ]25[، حضور سلول­هایی از سه لایه جنینی در این تومور، نشان دهنده ظرفیت تمایزی بالای این سلول­هاست بنابراین استفاده درمانی از این سلول­ها با مشکلاتی همراه است]7[.
2-1- سلول­های بنیادی بالغ
سلول­های بنیادی بالغ، سلول­های سوماتیکی هستند که در بافت بالغ حضور دارند و قادرند به سلول­های بنیادی بالغ، سلول­های سوماتیکی هستند که در بافت بالغ حضور دارند و قادرند به سلول­های بافتی که از آن منشا می­گیرند، تمایز یابند. این سلول­ها را می‌توان در بافت­هایی مثل استخوان تیغه‌ای (ترابكولار)، بافت چربی، مغز، سینوویوم، عضله اسكلتی، ریه، طحال، كبد، كلیه، مغز استخوان، غضروف، قلب، پوست، دندان­های شیری و سلول­های اطراف عروق مربوط به ژله‌ وارتون بند ناف انسان نیز مشاهده نمود [14،26]. یکی از نکات مهم در مورد سلول­های بنیادی بالغ این است که تعداد آن­ها در هر بافتی محدود است. این سلول­ها در حالت عادی در ناحیه خاصی از هر بافت به صورت خاموش به حالت تقسیم نشده وجود دارند و قادرند تحت شرایط فیزیولوژیک یا بدنبال ایجاد ضایعه، به سلول­های بافتی كه در آن قرار دارند تمایز یابند و بافت آسیب دیده را ترمیم كنند و یا تحت شرایط خاصی نیز به به سلول­های دیگری كه مربوط به آن بافت خاص نمی‌باشد تمایز می‌‌یابند، به این ویژگی Trans-differentiation و یا Adult­ stem cell plasticity می‌گویند [3،27،28].
Ferrari و همکارانش در سال 1998 اولین بار differentiatio Trans- سلول­های BMSCs  را به سلول­های عضلانی و در همان سال Shi و همکارانش تولید سلول­های اندوتلیال از BMSCs را گزارش دادند]29،30[.Petersen  تولید سلول­های کبدی از مغز استخوان را بعد از آسیب کبدی و Brazelton و همکارانش در سال 2000  تولید نورون از  BMSCs را گزارش دادند ]31،32 .[در سلول­های استخراج شده از بافت­های دیگر مانند عضله اسکلتی ]33 [و مغز ]34 [نیز این قابلیت تمایزی مشاهده شده است. امروزه فناوری سلول­های بنیادی و قابلیت تمایز آن­ها به انواع سلول­های بالغ و همچنین استفاده از آن­ها در درمان بیماری­ها به طور روز افزونی در حال پیشرفت بوده که امیدواری­هایی را در جهت ایجاد روش­های مبتنی بر سلول درمانی به عنوان یک جایگزین مناسب برای پیوند اندام کامل ایجاد نموده است.
1 progenitor
2  Niche
3 symmetric
4 asymmetric
1 Totipotent
2 Pluripotent
3 Inner cell mass
4 Multipotent
5 adult Stem Cell
6 Embryonic Stem Cell
تعداد صفحه : 115
قیمت :14700 تومان

بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        *       serderehi@gmail.com

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

 

[add_to_cart id=154208]

—-

پشتیبانی سایت :       

*         parsavahedi.t@gmail.com