دانلود پایان نامه

احمديان يزدي و همکاران (1381)، نماتد گالزاي برگ بادام (احتمالاً از جنس Mesoanguina) را از جنوب استان خراسان براي اولين بار از ايران گزارش نمودند.
باروتي و همكاران (1381)، با مطالعه فون نماتدهاي انگل گياهي جنوب بلوچستان، چهارگونه نماتد را براي اولين بار از ايران گزارش نمودند كريمي پور (1381)، 20 گونه متعلق به 15 جنس از نماتدهاي انگل گياهي راسته Tylenchida در گياهان مهم زراعي استان تهران را شناسايي نمود كه دو گونه براي اولين بار از ايران و يك گونه براي دومين بار در دنيا گزارش مي شد. ابراهيمي (1381)، با مطالعه فون نماتدهاي انگل گياهي راسته Tylenchida در مزارع چغندرقند استان فارس 27 گونه متعلق به 15 جنس را مورد شناسايي قرار داد كه هفت گونه آن براي اولين بار از ايران گزارش مي شد. كارگر بيده (1381)، تعداد 35 گونه از 19 جنس نماتدهاي انگل گياهي از راسته Tylenthida مزارع چغندرقند استان همدان را مورد شناسايي قرار داد. رزاز هاشمي (1381)، فون نماتدهاي مهم انگل ريشه تعدادي از درختان و درختچه هاي جنگلي استان قزوين را مورد مطالعه قرار داد و 11 گونه نماتد متعلق به هشت جنس از راسته Tylenchida را شناسايي نمود. جهانشاهی افشار (1382)، 36 گونه نماتد متعلق به 21 جنس از راسته Tylenchida روی درختان میوه در منطقه جیرفت استان کرمان شناسایی نمود.
باروتي و حسيني نژاد در سال 1383 در بررسي، برخي از باغات استان كرمان 20گونه نماتد گياهي متعلق به 9 خانواده را گزارش كردهاند كه مهمترين آنها به قرار ذيل ميباشند: M. javanica، M. incognita، Trichodorus sp.، Xiphinema index، X. vuittenezi ، Longidorus africanus،Criconema mutabile، Geocenamus brevidens، G. rogusus ، Helicotylenchus digonicus ، Paratylenchus projectus ، P. neglectus ، P. thornei و Zygotylenchus guevarai

3-1- نمونه برداري
در سالهاي 1388 و 1389 طي مسافرت به نقاط مختلف سردسيري و گرمسيري استان قم جمعاً 140 نمونه خاک و ريشه جمع آوري گرديد (نقشه شماره 3-1). بدليل يکسان نبودن پراکنش نماتدها در خاک،‌هر يک از نمونه ها از ترکيب چند نمونه کوچک (Sub samble) بدست آمد. نحوه نمونه برداری به این شکل بود که در محل هایی که اطلاعات و سوابقی مبنی بر حضور نماتد یا علائم احتمالی ناشی از خسارت آنها موجود بود، از آن محل نمونه برداری صورت گرفت، در غیر این صورت بسته به وسعت باغ، از نقاط مختلف نمونه برداری انجام شد. نمونه برداری از خاک اطراف ریشه بوده و در صورت وجود ریشه های عمیق این کار به کمک مته مخصوص (Auger) و از اعماق مختلف خاک (90-50 سانتیمتر برای پسته و 60-30 برای انگور) صورت گرفت. از ریشه گیاه مورد نظر نیز به نمونه خاک اضافه گرديد. پس از جمع آوری زیر نمونه ها، آنها را کاملاً مخلوط کرده و حدود یک تا یک و نیم کیلوگرم از آن به عنوان نمونه اصلی انتخاب و در یک کیسه پلاستیکی ریخته، مشخصات لازم از قبیل: نام گیاه، محل نمونه برداری و تاریخ نمونه برداری ثبت و به نمونه الصاق شد. سپس نمونه ها به آزمایشگاه نماتدشناسی منتقل و تا شروع کار در یخچال (حرارت چهار تا پنج درجه سانتی گراد) نگهداری شدند.
3-2- استخراج نماتدها
3-2-1- استخراج نماتدها از خاک
براي استخراج نماتدها از خاک، ابتدا هر يک از نمونه ها به دو قسمت تقسيم و سپس از دو روش استفاده گرديد. الف– روش تکميلي الک و سانتريفيوژ (De Grisse, 1969)، که کاملترين و سريع ترين روش در استخراج نماتدها است. ب- روش وايت هد (Whitehead method) يا روش سيني (Tray)، که در حقيقت همان روش تغيير يافته قيف برمن مي باشد (باروتي و علوي،1374). در اين روش خاک را با عمق کم (حدود يک سانتيمتر) روي يک پارچه يا دستمال کاغذي که روي يک الک پلاستيکي با سوراخهاي درشت قرار داشت، پخش شدند. سپس الک را داخل يک ظرف کم عمق قرار داده به طوريکه سطح آب دقيقاً به خاک رسيد. پس از 24 ساعت به تدريج نماتدهاي زنده و فعال در کف ظرف زيري جمع شدند. در نهايت براي کم کردن حجم، آب حاوي نماتدها از دو الک 400 و 500 مش عبور داده شد.
3-2-2- استخراج نماتدها از بافتهاي گياهي
تعدادي از نماتدهاي انگل گياهي در داخل بافت ميزبان فعاليت مي کنند که مي توان به نماتدهاي انگل داخلي ريشه اشاره کرد. براي جداسازي اين گروه از نماتدها روشهاي مختلفي پيشنهاد شده است که در مجموع، اساس تمامي آنها يکسان و بر تحريک نماتد به خروج از بافت و رسوب آن در آب استوار است. به منظور استخراج نماتدهاي مولد زخم از داخل ريشه از روش قيف برمن (Baermann funnel) استفاده شد. به اين صورت که مقداري از اندام هاي گياهي خرد شده مورد نظر را روي کاغذ صافي يا درون پارچه ململ قرار داده سپس آن را درون قيف گذاشتيم (قبلاً لوله انتهايي قيف بسته و تا نصفه پر از آب شده بود). پس از 24 ساعت به تدريج نماتدها در آب انتهاي لوله پلاستيکي قيف جمع شدند.
3-2-3- جداکردن توده تخم و نماتدهای ريشهگرهاي Meloidogyneاز ریشه های آلوده
برای جداسازی نماتدهای متورم و گلابی شکل از ریشه، ابتدا ریشه های داراي گال را به آرامی با آب شسته تا ذرات خاک جدا گردد. سپس قطعات کوچکی از آنها داخل یک پتریديش یا شیشه ساعت قرار داده شد. گالها به دقت در زیر بینوکولر بررسی گرديدند. ابتدا توده تخم از انتهای بدن ماده بالغ داخل ريشه برداشته شد سپس ماده گلابی شکل شفاف با احتیاط توسط سوزن و اسکالپل از بافت ریشه جدا و در پتريديش های حاوی آب نگهداري شدند. بعد از جدا کردن تعداد کافی از نماتدهاي ماده بالغ، اقدام به برش از انتهای بدن آنها گرديد
3-2-3-1- شبکه کوتيکولي انتهايي بدن نماتد ماده :
کوتيکول در انتهاي بدن ماده ها به شکل اثر انگشت مي باشد که Perineal Pattern نيز ناميده ميشود، در واقع يکی از مهمترين شاخصهای نماتدهای ريشهگرهاي است که در تشخيص و شناسايي گونه های اين جنس از اهميت خاصي برخوردار است، اگرچه اختلافات و يا تغييراتي در شکل افراد يک جمعيت يا گونه وجود دارد ولي خصوصيات اصلي به ميزان زيادي ثابت است، خصوصيات شکل اين شبکه شامل شکل عمومي کلي، وجود يا فقدان شيارهاي مشخص در ناحيه خطوط جانبي، نقطه نقطه بودن ناحيه انتهايي دم و شکل و فرم خطوط مي باشد. در هر حال زماني که اختلافات بين گونهها يا جمعيتها قابل توجه نباشد، تشخيصها قطعي نبوده و به علت همپوشاني خصوصيات مرفولوژيک استفاده از ساير صفات تاکسونوميک الزامي است (Eisenback, 1985).
3-2-3-2- تهیه برش از شبکه کوتیکولی انتهای بدن ماده های بالغ جنس Meloidogyne
براي اين منظور از روش ارايه شده توسط جپسون(Jepson 1987) استفاده شد. بر همين اساس ابتدا نماتدهای مادهای را که قبلاً به تعداد کافی از بافت ریشه جدا شده بودند روی یک قطعه طلق حاوي چند قطره اسيد لاكتيك 45 درصد قرار داده شدند و سپس توسط اسکالپل بدن نماتد از نيمه برش داده شدو با فشار سوزن کوچکی روی بدن نماتد، محتویات بدن خارج گردید. کوتیکول یا جلد خالی و حباب مانند نماتد در چند قطره محلول 45 درصد اسید لاکتیک تميز و روی طلق به مدت 5 تا 10 دقيقه قرار داده شد. (اسید لاکتیک جدا شدن اجزاء چسبیده به کوتیکول را آسان می سازد) سپس با دقت برش دیگری از انتهای بدن نماتد تهیه گردید. قطعه بریده شده شامل نقش انتهای بدن به اندازه یک مربع کوچک آرایش گردید و محل نقش تناسلی و مخرج کاملاً تمیز شدند. سپس قطعات بریده شده به قطره کوچک گلیسیرین در روی یک لام منتقل گردیدند و لاملی به آرامی روی قطره گلیسیرین قرار داده شد و دور لامل نیز با چسب Glyceelپوشانده و مسدود گردید و از اسلایدهای مقاطع تهیه شده برای شناسایی گونه های جنس Meloidegyne استفاده شد.
3-3- کشتن، تثبيت و انتقال نماتدها به گلسيرين:
پس از استخراج نماتدها به منظور مطالعات بيشتر، لازم است عملياتي در جهت کشتن و ثابت کردن و انتقال نماتدها به گلسيرين خالص انجام شود تا امکان نگهداري آنها در دراز مدت فراهم گردد. در اين تحقيق از روش تکميل شده دگريسه (De Grisse, 1969) براي اين منظور استفاده شد.
3-4- تهيه اسلايد ميکروسکوپي
3-4-1- تهیه اسلایدهای موقت:
به دلیل اینکه بعضی از اندامهای بدن نماتدها در حال زنده، بهتر و مشخصتر از حالت ثابت شده قابل رؤیت میباشد، در اغلب موارد از اسلاید موقت استفاده گردید. برای انجام این عمل یک قطره کوچک آب وسط یک لام تمیر قرار داده و به کمک یک سوزن ظریف نماتدها را در زیر بینوکولر از ظرف محتوی نماتدها برداشته و به قطره آب منتقل و سپس چند قطعه کوچک پشم شیشه هم قطر نماتدها قرار داده و سپس به آرامی و به ملایمت لامل را روی قطره آب قرار داده و اطراف آن با چسب مسدود گردید . برای بیحرکت نمودن نماتدها بهتر است لام قبل از چسب زدن روی شعله چراغ الکلی کمی حرارت داده شود.
3-4-2- تهيه اسلايد ميکروسکوپي دائم :
براي انجام مطالعات دقيقتر از نماتد تثبيت شده در گلسيرين، اسلايدهاي ميکروسکوپي دائمي تهيه شد. براي تهيه اسلايد دائمي، ابتدا در وسط يک لام تميز، به وسيله يک لوله آزمايشي، حلقه پارافيني به قطر 15 ميليمتر ايجاد گرديد. در وسط اين حلقه يک قطره کوچک گلسيرين قرار داده و سپس نماتدهاي مورد نظر به داخل قطره منتقل شدند. پس از منظم کردن نماتدها در وسط قطره، لامل تميزي را روي آن قرار و لام را به آرامي حرارت داده تا پارافين آن ذوب شده و قطره گلسيرين را احاطه نمايد. در حرارت دادن لام دقت کافي لازم است تا حباب هوايي در زير لامل ايجاد نشود و از لغزش احتمالي آن جلوگيري گردد. سپس لام را روي سطح صافي قرار داده تا پارافين دوباره سرد شود. بعد از اتمام کار، در دو طرف لام برچسب زده شد که در يک طرف مشخصات نماتد (نر يا ماده بودن، تعداد و اسم جنس و گونه) و در طرف ديگر تاريخ، نام تهيه کننده پرپاراسيون و محل جمع آوري نمونه ثبت گرديد.
3-5- روش و اساس طبقه بندي نماتدها