مقاله رایگان با موضوع شیمیایی و مطالعه

3-2- روش ها و آزمایشات
3-2-1- جداسازی سویه های باکتریایی از سرکه و بررسی تولید سلولز توسط آن ها
به منظور جداسازی این دسته از میکروارگانیسم ها، جمع آوری از نمونه های متعدد سرکه انجام شد . برای این منظور نمونه برداری از سرکه های محلی شهرستان شاهرود و دامغان و حومه شهرستان ها انجام شد. نمونه ها پس از تهیه به آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشگاه آزاد دامغان انتقال داده شد و ابتدا جهت جداسازی باکتری گرم منفی استوباکتر1/0 سی سی از نمونه سرکه درون محیط کشت هسترین-شرام آگار کشت داده شد و به مدت 72-24 ساعت در دمای 30 درجه سلسیوس گرمخانه گذاری شد مرحله مذکور تا به دست آمدن تک کلونی های خالص تکرار گردید. پس از آن کلونی ها از نظر خصوصیات فنوتایپی و تست های متداول بیوشیمیایی بررسی شدند. همگام با این بررسی، سویه استوباکتر زایلینوس باPTCC شماره(1734) به عنوان شاهد از کلکسیون قارچ ها و باکتری های صنعتی ایران خریداری گردید و در مرحله بعد، یک لوپ از کلونی های فوق به طور جداگانه به درون ارلن های 100 سی سی حاوی محیط کشت شرام – هسترین مایع ومایع مغذی اضافه شد و پس از آن نمونه ها به مدت 1 هفته در دمای 30 درجه سلسیوس گرمخانه گذاری گردید. باکتریهای خالص شده از نظر تشکیل و یا عدم تشکیل لایه سفید رنگ، لزج، محکم و قطور بر روی محیط کشت مایع مورد بررسی قرار گرفتند و وجود توانایی تولید لایه سلولزی توسط باکتری ها تایید شد
(Dearing, 2000; Sattler and Fiedler, 1990; Saxena et al., 1994; Thawatchai et al., 2007 and Yong et al., 2012).
3-2-1-1- محیط کشت هیسترین اسکرام
مواد مورد استفاده در این محیط کشت در جدول 3-3 آورده شده است. به این ترتیب که ابتدا مواد ذیل با تناسب وزن، سپس با آب مقطر درون ارلن مخلوط و پس از اتوکلاو در دمای 121 درجه سلسیوس به مدت 15 دقیقه، آنتی بیوتیک نیستاتین (1 گرم در 100 سی سی آب مقطر به وسیله فیلتر میلی پور استریل شد) جهت خاصیت قارچ کشی در دوز مناسب به مواد فوق در ارلن اضافه شد و محیط کشت مزبور آماده گردید . مواد مورد استفاده در جدول 3-3 آورده شده است(et al., 2002 Ishihara).
جدول 3-3. مواد تشکیل دهنده محیط کشت هیسترین اسکرام
غلظت (بر حسب گرم) پیش مواد
2 گرم گلوکز
0/5 گرم عصاره مخمر
0/5 گرم پپتون
5/1 گرم آگار آگار
27/0گرم دی سدیم هیدروژن فسفات
115/0 گرم
100 سی سی اسید سیتریک
آب
3-2-2-انتخاب و شناسایی سویه های باکتریایی
از میان باکتری های جداسازی شده، جهت مطالعات بیشتر، آنهایی انتخاب شدند که توانایی تولید لایه سلولزی را داشتند و شناسایی بر روی این سویه ها انجام شد.
به این صورت شناسایی سویه های باکتریایی از دو طریق شناسایی فنوتایپی و ژنوتایپی انجام گردید.
3-2-2-1-بررسی های فنوتایپینگ سویه های باکتریایی
جهت شناسایی سویه ها همانطور که در بخش 2-2-1 آمده است، از خواص ماکروسکوپی و میکروسکوپی آن ها استفاده گردید. در بررسیهای ماکروسکوپی کشت 12 تا 24 ساعته از هر باکتری در محیطهای کشت هیسترین اسکرام آگار بررسی شد که حالت، شکل، منظره سطح، رنگ و اندازه کلنیها بررسی گردیدند.
3-2-2-1-1-رنگ آمیزی گرم
جهت رنگ آمیزی هر باکتری، کشت تازه از باکتری در محیط کشت هیسترین اسکرام آگار تهیه شد و برای رنگ آمیزی مورد استفاده قرار گرفت. به منظور بررسی خصوصیات میکروسکوپی باکتری و همچنین تشخیص نوع واکنش گرم، لامهای متوالی در زمان های 12، 24 و 48 ساعت پس از کشت باکتری تهیه و با رنگ آمیزی گرم رنگ آمیزی و مطالعه گردید.
3-2-2-1-2- روش لام مرطوب