پاراکوویروس، میکروتیوب

ر عفونتهای HPEV در سنین کودکی و با شیوع فصلی (بیشترین پیک در اواخر تابستان و اوائل بهار) دیده می شود. اسهال مهمترین عارضه کلینیکی در عفونتهای HPEV است که گاهی با علائم تنفسی نیز همراه است. اگر چه گرفتاری CNSدر این بیماران بسیار نادر است ولی مواردی هم از انسفالیت مرتبط با عفونتهای HPEVI گزارش شده است که گاهی اوقات منجر به فلج نیز می شود. عفونت هایHPEVI اغلب با علائم گاستروانتریک همراه می باشند (۹۳ و ۱۱۴).
درسوئدیک پاراکوویروس بنام L junganvirusرا از نژادی از موشهای اروپایی clethrionomysglareolus))ایزوله نمودند (۱۱۵). این ویروس و موش های وابسته به آن در بخش کدکننده پروتئین های کپسیدی خود یک همولوژی با پاراکوویروس ها دارند. بین اسیدهای آمینه پروتئین VP3در ویروس Ljungan و پاراکوویروس های انسانی حدود ۷۰ درصد تشابه دیده می شود از طرف دیگر ویروس Ljungan واجد یک انتهای آمینی بازی در VP3می باشد. قبلاً این توالی فقط در پاراکوویروس انسانی مشاهده شده بود. توالی vpo ویروس Ljunganهم به میزان زیادی با پاراکوویروس ها تشابه دارد اگر چه انتهای آمینی آن کوتاه تر است. جداسازی این ویروس در موش دلیلی بر زئونوز بودن ویروس است (۱۱۵ و ۱۱۶).
در گذشته تشخیص آلودگی به پاراکوویروس ها از طریق کشت سلول که وقت گیر بود و آلودگی زیادی ایجاد می گردد صورت می گرفت اما امروزه با تعیین توالی پاراکوویروس ها و بالا رفتن اطلاعات مولکولی و پیشرفت تکنیک های مولکولی با استفاده از PCR – RT که روشی سریع، حساس و اختصاصی است تشخیص صورت می گیرد (۱۰۷و ۱۰۶و ۱۰۵).
با راه اندازی روش اختصاصی RT – PCR برای تشخیص سریع این ویروس می توان با صرف هزینه و وقت کمتر این ویروس را در نمونه های کلینیکی تشخیص دادو با تشخیص سریع گاستروآنتریت ویروسی از مصرف آنتی بیوتیک بی موردجهت ایجاد مقاومت نسبت به آنتی بیوتیک جلوگیری می شود.
(۲-۱فرضیه:
۱-بین گاستروآنتریت و پاراکوویروس تیپ یک انسانی ارتباط وجود دارد.
۲- می توان به کمک پرایمرهای اختصاصی طراحی شده بر اساس اطلاعات توالی ژنوم پاراکوویروس تیپ یک، این ویروس را از نمونه های کلینیکی کودکان ایرانی مبتلا به گاستروآنتریت جدا نمود.
۳- توالی ژنوم پاراکوویروسی جدا شده از مدفوع کودکان ایرانی با توالی موجود در Gene bank تطابق دارد.

(۳-۱ هداف تحقیق:
۱-اهداف علمی:
جدا کردن سریع پاراکوویروس انسانی از نمونه های کلینیکی به روش RT- PCR
۲- کاربردی:
با صرف هزینه و وقت کمتر این ویروس ر ا در نمونه های کلینیکی می توان تشخیص داد و با تشخیص سریع گاستروآنتریت ویروسی از مصرف آنتی بیوتیک بی مورد جهت جلوگیری از مقاومت جلوگیری می شود.
(۴-۱ضرورت انجام تحقیق:
تاکنون مطالعه روی این ویروس ها در ایران انجام نشده و اغلب ویروس ها را توسط کشت سلولی تشخیص و جدا می کنند و این ویروس چون کندرشد می باشد با استفاده از ر وش RT – PCR سریعتر می توان آنرا جدا نمود و از عفونت های باکتریال تشخیص داد و از مصرف آنتی بیوتیک نا به جا خودداری نمود.

فصل دوم
مروری بر متون گذشته

پاراکوویروس تیپ یک اسم قبلی آن (اکوویروس ۲۲) در سال ۱۹۵۶از یک اسهال تابستانی جدا شده است پاراکوویروس انسانی غالباً در اواخر تابستان و اوایل پاییز جدا شده و در کودکان زیر ۵ سال ایجاد گاستروآنتریت می کند که اسهال از علائم بالینی بارز آن هاست. در سال های ۲۰۰۴ تا ۲۰۰۶ در هلند با استفاده از RT- PCR و نمونه های مدفوع کودکان در صد زیادی از Pevlجدا شده که عامل گاستروآنتریت بوده و علائم آن شبیه با عفونت انتروویروس های انسانی است (۱۰۱) ولی این گروه بدلیل اختلاف ژنتیکی که با گروه انتروویروس ها دارد به روش RT- PCR انتروویروس ها تشخیص داده نمی شوند و باید برای این گروه پرایمرهای اختصاصی طراحی گردد (۱۰۶- ۱۰۲).
مطالعات در فنلاند نشان می دهد که سن متوسط آلودگی با این ویروس ۱۸ ماهگی می باشد. %۲۰ در سال اول زندگی آلوده می شوند. در مطالعات جدید در فنلاند و سوئد نشان داده شده که %۹۵ نوزادان دارای آنتی بادی Pevlهستند (مادری) در صورتیکه فقط %۲۰ بچه های بین ۱۲-۶ ماهگی سرم مثبت بوده اند و سرم مثبت ها در سال بعد زندگی بسرعت افزایش می یابند و در بالغین %۷ سرم مثبت می باشند، بنابراین عفونت Hpevlرا دارا می باشند (۱۰۸و ۱۰۳). با توجه به اینکه در ایران هیچگونه بررسی راجع به این ویروس انجام نشده در این مطالعه با استفاده از روش RT-PCRاختصاصی Hpevرا از مدفوع کودکان جدا خواهند نمود (۱۰۸و ۹۶).
مطالعات کافی و همکاران نشان داد که سن آلودگی در ایران اغلب در کودکان زیر یک سال و در اوایل پاییز می باشد. (۱۲۴) مطالعات در سال ۲۰۰۷ بین ماه های ژانویه و دسامبر با استفاده از تکنیک PCR نشان داد که HPEV علاوه بر بیماری گاستروآنتریت سبب مننژیت یا سپتیس هم می شود. در این تحقیق نشان داده شده که Hpev1, Hpev6, Hpev3باعث مننژیت می شود (۱۱۷).
در یک مطالعه بر روی نوزادان اسرائیلی تأثیر Hpev3را بر روی عفونت سیستم عصبی مرکزی بررسی کردند در این تحقیق با استفاده از تکنیک RT- PCR طی مدت ۵ سال نمونه های CNSمشکوک بررسی شد این مطالعه نشان داد که افراد درگیر کودکانی کمتر از ۳ سال هستند, با علائم بالینی کمبود گلبول سفید و سلول بتا. شناختن سریع Hpevدر CSFمی تواند در درمان آنتی بیوتیکی و توقف کوتاه مدت در بیمارستان مؤثر باشد (۱۱۸).
در کره جنوبی تحقیقاتی را بر روی بیمار
ی
که دچار مننژیت بود انجام دادند که عامل آن Hpev بود. در این مطالعه رنج سنی افراد مورد مطالعه کودکان ۱ روزه تا ۱۵ ساله بود که با استفاده از تکنیک RT- PCR بر روی نمونه های CSFانجام شد. Hpev که در این مطالعه جدا شد pev3 بود که نمونهای مثبت بیشتر مربوط به کودکان زیر ۳ ماه بود (۱۱۹) .
در فنلاند مطالعاتی بر روی Hpev انجام شد که هدف کلی از این مطالعه اپیدمیولوژی Hpev انسانی در جمعیت فنلاند بوده که تکنیک مورد نظر RT- PCR بود و تعیین ژنوتیپ این ویروس با تعیین سکانس VP1انجام شد. این مطالعه نشان داد که در فنلاند بیشترین شیوع Hpev مربوط به تیپ ۱ بود (۹۳%) اگر چه تیپ های ۳ و ۶ بندرت وجود داشته و افراد درگیر کودکان زیر ۲ سال بودند و این ویروس در سرتاسر سال وجود داشته ولی بیشترین فصل شیوع آن پاییز بوده است (۱۲۰).
در شانگهای چین نمونه مدفوع بچه های زیر ۵ سال در سال ۲۰۰۹- ۲۰۰۸ مورد بررسی قرار گرفت در این مطالعه ژنوتیپ بارز Hpev1 بود, سپس Hpev4 وکمترین میزان جدا شده Hpev5 بود و بیشترین میزان شیوع عفونت در ماه های July ، Agust بود. هدف کلی از این مطالعه ارزیابی شیوع و تنوع ژنوتیپ Hpevدر شانگهای چین بوده است (۱۲۲).
در ژاپن Hpev را از نمونه های مدفوع کودکان مبتلا به گاستروآنتریت حاد با استفاده از تکنیک PCR اختصاصی به وسیله یک جفت پرایمر تهیه شده از ناحیه ۵´UTR ژنوم این ویروس و تعیین ژنوتیپ آن بوسیله تعیین توالی نوکلئوتیدی ژن VP1جداکردند که از ۱۷ نمونه مثبت شده ۱۵ نمونه آن Hpev1 2نمونه Hpev3بوده (۱۲۱).
در مطالعاتی که در فنلاند انجام شد تاثیر Hpev1را بر روی سلول های که مورد بررسی قرار دادند و نشان دادند که تیپ یک با تخریب سلول های β باعث بیماری دیا بت نیپ ۱ می شود (۱۲۳).

فصل سوم
مواذ و روشها

*مواد و روش ها:
تعداد ۲۵۰ نمونه مدفوع مربوط به کودکان زیر چهار سال با علائم اسهال، از بیمارستان تشخیصی طبی کودکان مورد بررسی قرار گرفت.
(۱-۳آماده سازی میکروتیوب و سرسمپلرها:
برای جلوگیری از آلودگی احتمالی میکروتیوب ها و سر سمپلرها با آنزیم RNase ، این وسایل قبلاً به مدت یک شبانه روز در
محلول ۱% (حجمی حجمی) (Drethyl pyrocarbonate) DEPC قرار گرفتند و سپس اتوکلاو شدند.
محلول DEPC ترکیبی است که ساختمان پروتئینی آنزیمهای RNase و ساختار اسیدهای نوکلئیک را تخریب میکند لذا پس
از مجاورت وسایل پلاستیکی با آن لازم است برای جلوگیری از اثرات مخرب آن بر RNA، وسایل اتوکلاو شوند تا DEPCغیر فعال گردد..
(۲-۳مواد لازم برای تهیه سوسپانسیون:
ابتدا محلول های زیر تهیه و به طور جداگانه به مدت ۲۰ دقیقه اتوکلاو شدند.
محلول A:
(PH=7.4) PBS شامل NaCl (g8)، KCl (g2/.) ، Na2HPO4 (g 91/.) و KH2PO4(g 12/.) درml1000
محلول B‌: MgCl2.6H2O (g/100ml1/.)
محلول C: CaCl2 (g/100ml1/.)
برای تهیه محلول کار مورد نیاز ۱ حجم از محلول B با ۱ حجم از محلول C‌و ۸ حجم از محلول A مخلوط گردید. برای تهیه
سوسپانسیون از نمونه های مدفوع ۴ml از محلول کار با ۱ml کلروفرم در لوله فالکون ۱۵ ml مقاوم به کلروفرم مخلوط و
حدود، ۲ گرم مدفوع با سواپ به آن افزوده شد. لوله ها به مدت ۲۰ دقیقه روی شیکر قرار گرفتند و سپس به مدت ۱۵ دقیقه
در ۴°C با دور g 1500 سانتریفوژ شدند. محلول روئی حاوی ویروس بوده و ۲۰۰ ml از آن برای استخراج RNA به سرعت
به میکروتیوب ۱/۵ ml منتقل شد و بقیه نیز در فریزر°C -20 نگهداری گردید.

*RT-PCR:
با توجه به اینکه پاراکوویروس تیپ یک انسانی RNA ویروس است. بنابراین از روش RT-PCR استفاده گردید و پس از
جداسازی RNA از آن بعنوان الگو برای ساخت cDNA استفاده شده و ، cDNA‌تهیه شده برای تکثیر به روش PCR‌ به
میکروتیوب دیگری منتقل گردید. جزئیات در زیر توضیح داده شده است.
(۳-۳ جداسازی RNA و ساخت cDNA:
برای جداسازی RNA از محلول( RNXشرکت سیناژن باcat:RN7713C) که حاوی( guanidine salt وphenol solu. )میباشد به شرح زیر طبق پروتوکل کیت مربوطه استفاده شد :
در یک میکروتیوب ۱/۵ ml که حاوی ۲۰۰ μl از سوسپانسیون است ۸۰۰ μl محلول RNX اضافه کرده و به مدت ۱۵-
۱۰ ثانیه با دست تکان میدهیم. سپس به مدت ۵ دقیقه در دمای اتاق قرار داده و پس از آن ۲۰۰ μl کلروفرم به آن اضافه
کرده، ۳۰-۱۵ ثانیه به شدت آنرا تکان میدهیم و به مدت ۵ دقیقه در°C20- قرار داده، سپس در °C4 به مدت ۱۵ دقیقه با
دور ۱۲۰۰۰ g سانتریفوژ کردیم . بعد از سانتریفوژ محلول داخل میکروتیوب حاوی ۳ فازاست که فاز رویی فاز آبی بوده و
حاوی RNA است. فاز میانی بسیار نازک و حاوی قطعات تخریب شده ویروسی و فاز انتهایی که زرد رنگ است حاوی مخلوط
کلروفرم و محلول استخراج ویروس می باشد. فاز رویی را به آرامی به کمک سمپلر جدا میکنیم به نحوی که هیچ تداخلی با فاز
میانی پیدا نکند. حجم این بخش حدود ۸۰۰ μl است و به یک میکروتیوب استریل جدید منتقل میشود و هم حجم آن
ایزوپروپانول به آن افزوده میشود. برای تشکیل رسوب به مدت ۲-۱ ساعت در فریزر ۲۰°C- قرار می دهیم و سپس آنرا در°C
۴ درجه به مدت ۱۵ دقیقه با دور ۱۲۰۰۰ g سانتریفوژ میکنیم . محلول روئی را خالی کرده و ۵۰۰ μl اتانول ۷۰% اضافه
کرده و به مدت ۳ دقیقه با دور ۷۵۰۰ g در°C 4 سانتریفوژ می‌کنیم. در این مرحله رسوب RNA در ته میکروتیوب قابل
رویت است. الکل را خالی کرده و میکروتیوب را به صورت وارونه بر روی دستمال تمیز قرار میدهیم تا اتانول آن تبخیر شود
زیرا اتانول موجود در میکروتیوب در صورت عدم تبخیر موجب تداخل در مراحل PCR می شود. باید دقت کنیم که ضمن
خشک شدن الکل رسوب کاملا خشک نشود زیرا در میزان RNA آن نقصان ایجاد میشود. با توجه به اندازه رسوب موجود در
میکروتیوب μl25- 12 DEPC treated water به آن اضافه کرده وبه مدت ۱۰- ۵ دقیقه در بن ماری °C60- 55 قرار
می دهیم ( حرارت به باز شدن ساختارهای ثانویه احتمالی در RNA کمک میکند) و بلافاصله به یخ منتقل می کنیم تا
بسرعت وارد مرحله ساخت cDNA بشود. نگهداری RNA برای مدت طولانی فقط در فریزر°C80- امکان پذیر است.
(۴-۳سنتز cDNA:
برای سنتز cDNA از کیت سنتز cDNA استفاده می کنیم. طبق پروتوکل کیت به میزان۱۰ng-5μg RNA نیازمندیم .میزان RNA استخراج شده را با کمک دستگاه نانودراپ بدست آوردیم و با توجه به دستور پروتوکل میزان μl9 از RNA را برداشته و به آن oligo dT به میزان ۱μlاضافه کرده به مدت ۵ دقیقه در دمای ۶۵°C ‌قرار می دهیم سپس به میزان ۱۰μlاز محلولPrimix RT اضافه کرده ( حجم نهایی ۲۰μl) و طبق جدول زیر انکوبه میکنیم .
زمان
دما
۵ دقیقه
۶۰ دقیقه
۱۰ دقیقه
۲۵ درجه
۵۰ درجه
۷۰ درجه
cDNA تهیه شده به یخ منتقل شده و بلافاصله بعنوان الگو در واکنش PCR به کارگرفته میشود. و یا در۸۰ – نگهداری می شود.
روش تهیه کنترل مثبت(C+) برای PCR :
برای انجام PCR ما نیازمند به کنترل مثبت بودیم ولی چون نمونه پاراکوویروس را در اختیار نداشتیم , از پلاسمید PFG1 که حاوی کل ژنوم HPEV1 بود توسط خانم دکتر قاضی تهیه شده و استفاده نمودیم .
۳-۵) تهیه محیط کشت های مورد نیاز برای Compatent:
برای این مرحله به محیط کشت آگار و براث بدون آنتی بیوتیک برای کشت و تکثیر سلولها قبل از ترانسفورم و محیطهای
واجد آنتی بیوتیک برای کشت و رشد سلولهای ترانسفورم شده نیازمندیم . پلاسمید PFG1 دارای ژن مقاومت به آمپی سیلین
است لذا از این آنتی بیوتیک در محیط کشت استفاده شد.

جدول۴ -تهیه محیط کشت :
محیط کشت
آمپی سیلین
Yeast extract(g)
Nacl (g)
Trypton (g)
Agar(g)
LA

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *