نوامبر 25, 2020

پایان نامه جدید اصلاح شده- قسمت ۹

مواد مورد نیاز

مقدار در یک واکنش

آب دیونیزه

ml 23

استات آمونیوم (M 1)

ml 1

اتانول مطلق

ml 76

۳-۸- استخراج آر‌ان‌ا

جهت استخراج آر‏ان‏ا از کیت شرکت Vivantis (Extraction kit RNA GF-1 Total) استفاده شد.

۳ – ۸- ۱- روش کار

۱- به میزان mg 100 از بافت گیاهی همراه با ازت مایع به خوبی پودر شد (تیوب بر روی یخ نگهداری شد).
۲- به میزان µl 400 بافر TR یا بافر HR به بافت پودر شده اضافه شد و به شدت مخلوط شد.
۳- نمونه‌ها به مدت ۳ دقیقه در بالاترین سرعت سانتریفیوژ شد.
۴- محلول رویی به ستون‌ Homogenization منتقل شده و به مدت ۲ دقیقه در حداکثر سرعت سانتریفیوژ شد.
۵- به هر ستون µl 350 اتانول %۸۰ اضافه شد و پایپت شد.
۶- محلول شماره قبل به ستون RNA binding منتقل شد و سپس با سرعت g 10000 برای مدت ۱ دقیقه سانتریفیوژ شد. محلول جمع آوری شده در تیوب دور ریخته شد.
۷- به هر ستون µl 500 محلول شستشو اضافه شد و با حداکثر سرعت برای مدت ۱ دقیقه سانتریفیوژ شده و محلول جمع آوری شده در تیوب دور ریخته شد.
۸- به میزان µl 7 از آنزیم IDNase و µl 56 از بافر هضم و µl 7 بافرDigestion Enhancer بخوبی مخلوط شده و µl70 از این محلول به ستون آر‌ان‌ا اضافه و در دمای اتاق برای مدت ۳۰ دقیقه قرار داده شد.
۹- به میزان µl 500 بافر Inhibitor به ستون اضافه و ستون را با حداکثر سرعت برای مدت ۱ دقیقه سانتریفیوژ شد.
۱۰- محلول جمع آوری شده دور ریخته شد و lµ۵۰۰ بافر شستشو به ستون اضافه و در g 10000 به مدت ۱ دقیقه سانتریفیوژ شد.
۱۱- مرحله شماره ۱۰ تکرار شد.
۱۲- محلول جمع آوری شده دور ریخته شد و ستون در g 10000 برای مدت ۱ دقیقه سانتریفیوژ شد.
۱۳- ستون در درون یک تیوب جدید قرار داده شد و µl 20 آب عاری از RNase به آن اضافه شد و سپس در g 10000 برای مدت ۱ دقیقه سانتریفیوژ شد سپس µl 10 آب عاری از RNase به آن اضافه و دوباره در g 10000 برای مدت ۱ دقیقه سانتریفیوژ شد.

نوشته ای دیگر :
فايل دانشگاهی - بررسی عکس العمل بازار سهام نسبت به اعلامیه های سود نقدی در بورس ...

۳-۹- سنتز رشته اول cDNA

سنتز cDNA با استفاده از کیت cDNA synthetase شرکت Fermentas انجام شد. مواد ذکر شده در جدول (۳-۷) را در یک تیوب ریخته، سپس تیوب برای مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۵۵ درجه سانتی‌گراد قرار داده شد و بعد از آن بلافاصله تیوب برای مدت ۱۰ دقیقه روی یخ قرار داده شد و سپس تیوپ برای چند ثانیه سانتریفیوژ شد و µl 1 از آنزیم Reverse transcriptase به محلول درون تیوب اضافه و برای مدت ۲ ساعت در دمای ۴۲ درجه سانتی‌گراد قرار داده و سپس ۱۰ دقیقه در دمای ۷۰ درجه سانتی‌گراد قرار داده شد.
جدول ۳-۷- مواد مورد استفاده در سنتز cDNA.

منبع فایل کامل این پایان نامه این سایت pipaf.ir است